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PK—15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建及鉴定

时间:2017-10-30 07:17:16 来源:千叶帆 本文已影响


  摘要:【目的】构建 PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库,为深入研究猪伪狂犬病病毒(PRV)与宿主细胞间的相互作用机制打下基础。【方法】提取PK-15细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA(ds cDNA),并对其进行均一化和Sfi I酶切处理。处理后的ds cDNA分别连接3种阅读框pGADT7-Sfi I载体,将连接产物转化至大肠杆菌BH5α构建三框cDNA初级文库,取三框cDNA初级文库进行混合扩增,通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集文库细菌提取文库质粒。【结果】3种读码框cDNA文库的库容量分别为3.0×106、2.0×106和2.0×106 CFU,文库实际扩增基数>150万CFU;一号和三号读码框的基因重组率均为100%,二号读码框的基因重组率大于93%。cDNA文库外源基因插入片段长度在500~3000 bp。cDNA文库质粒浓度约1.0 mg/mL,质粒收获量约3.0 mg。【结论】构建的PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库具有较高的重组率和库容量,符合酵母双杂交筛选要求,可用于研究PRV与PK-15细胞间的相互作用机制。
  关键词: PK-15细胞;酵母双杂交;三框cDNA文库;均一化;猪伪狂犬病病毒(PRV)
  中图分类号: S852.65 文献标志码:A 文章编号:2095-1191(2016)05-0726-05
  Abstract:【Objective】Yeast two-hybrid three-frame cDNA library of PK-15 cells was constructed, in order to lay the foundation for investigating interaction mechanism be(转载自:www.BdfQy.Com 千 叶帆 文摘:PK—15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建及鉴定)tween pseudorabies virus(PRV) and its host cells. 【Method】Total RNA was extracted from PK-15 cells, and the full-length double-strand cDNA(ds cDNA) was synthesized using SMART and LD-PCR, which was ligated to three-frame expression vector pGADT7-Sfi I after nomalization and Sfi I digestion, respectively. The ligation product was transformed into Escherichia coli to construct primary three-frame expression cDNA library. Three primary cDNA libraries were mixed and amplified. The capacity and recombination rate of library were determined by titer test and PCR identification. Finally, all bacteria were collected to extract library plasmid. 【Result】The capacities of three reading frame libraries were 3.0×106, 2.0×106 and 2.0×106 CFU, respectively. The practical amplification base of library was more than 1.5 million CFU. The recombination rates of three frame libraries were 100%, more than 93% and 100%, respectively. The inserted fragment of exogenous gene was 500-3000 bp in length. The plasmid concentration of cDNA library was about 1.0 mg/mL, the plasmid yield was about 3.0 mg. 【Conclusion】The constructed yeast two-hybrid three-frame cDNA library of PK-15 cells has high capacity and recombination rate, so which meet the requirements of yeast two-hybrid screening, can be used to research interaction mechanism between PRV and PK-15 cells.
  Key words: PK-15 cells; yeast two hybrid; three-frame cDNA library; normalization; pseudorabies virus(PRV)
  0 引言
  【研究意义】猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种猪急性传染病,主要引起妊娠母猪繁殖障碍、育肥猪生长停滞及哺乳仔猪死亡,死亡率最高可达100%(Klupp et al.,1995;Pomeranz et al.,2005;林俊等,2016),对全球养猪业造成巨大危害。PRV具有泛嗜性,能在多种体外培养的细胞内进行增殖,其中以PK-15细胞最敏感(殷震和刘景华,1997),但迄今为止关于PRV与PK-15细胞间相互作用的研究报道相对较少。酵母双杂交是研究蛋白质相互作用的一种重要技术手段(李向阳等,2015),因此构建PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库,可为采用酵母双杂交技术筛选与PRV蛋白相互作用的文库蛋白奠定基础,对揭示PK-15细胞抵抗PRV复制的分子机制也具有重要意义。【前人研究进展】鉴于PK-15细胞培养过程中生长速率快,且细胞扩增倍数显着提高,常用作构建cDNA文库的宿主细胞(王国栋等,2013;李文良等,2016)。田宏(2003)对猪瘟病毒(Clssical swine fever virus,CSFV)及其全长cDNA在PK-15细胞中的增殖表达特性进行研究,结果发现CSFV石门株强毒株能适应PK-15细胞,其全长cDNA亦可转染PK-15细胞,并证实病毒RNA在转染早期表达量较低,经过多次传代可提高病毒的抗原产量。薛白(2012)利用PK-15细胞扩增PRV,成功构建了PRV microRNA文库,证实PRV致病过程中确有microRNA存在,且发挥着重要的调控作用。王国栋等(2013)构建了PK-15细胞cDNA T7噬菌体展示文库,初级文库滴度为2.0×105 PFU/mL,扩增后滴度高达6.0×1010 PFU/mL,经PCR鉴定其文库重组率为95.83%。张辉(2014)利用酵母单杂交技术将合成的圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株,然后采用SMART合成PK-15细胞cDNA文库,将总cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化酵母诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内构建酵母单杂交cDNA文库;同时验证了PK-15细胞源蛋白(AP2α2、Elf4和ISCU)表达平对PCV2的复制调节作用,即Elf4和ISCU蛋白过表达能够显着增强PCV2的复制,而AP2α2蛋白过表达对PCV2的复制无显着影响。【本研究切入点】酵母双杂交cDNA文库是研究蛋白质相互作用的重要手段,但目前尚无PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建的研究报道。【拟解决的关键问题】通过构建PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库,进一步明确PRV与PK-15细胞间的相互作用关系,为阐明宿主细胞抵抗PRV复制的分子机制打下基础。
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    情侣旅行发的说说句子想呼吸着每座城市的空气,想感受着每座城市的人儿,想看着每座城市的风景。以下是由应届毕业生文学网小编J L为您整理推荐的旅行说说心情,更多相关信息请关注应届毕业生网。一颗说走就走的心,一个会拍照的情侣,一段甜蜜的旅程。一个人的旅行...

    情侣说说 日期:2017-06-05

  • 幼儿园笔顺笔画教案全

    幼儿园大班写字课教案怎么写教学目标:通过引导学习使学生提高认真上好写字课、必须写好汉字的思想认识,增强写好汉字的决心和信心。教学重点:写好字的重要性。教学难点:怎样写好字,如何树立信心。教具:范字挂图、多媒体课件相关资料。教学过程:一、引导阶段:...

    幼儿园教案 日期:2017-04-18

  • 中班社会领域教案

    幼儿园中班社会活动教案幼儿园中班社会活动教案《分享真快乐》活动目标:1、学习与他人分享食物、玩具、图书等。2、懂得抢别人的玩具是不礼貌的行为,体验分享带来的乐趣。活动准备:故事《明明的变形金刚》、幼儿自带的一些玩具或食物。活动重点:能与他人分享食物...

    中班教案 日期:2017-04-03

  • 小班美工教案生日蛋糕

    美术教案-生日蛋糕活动名称:生日蛋糕设计思想:本节课旨在通过祖国的生日,系列活动,让儿在身为中国人的自豪感中欣赏探知祖国博大精深的文化艺术底蕴,探索祖国传统艺术的美,能够从色彩造型等多重角度来创造美,表现美,本次主题旨在通过祖国的生日活动,使幼儿进...

    小班教案 日期:2017-02-27

  • 中班手工折纸教案20篇

    手工教案大白兔折纸2012~2013学年上学期大班手工教案陆良县龙海乡核桃村希望幼儿园李玉芬课题:小白兔(折纸)学科:手工制作年级:大班教学目标:1、通过教师引导和示范及幼儿动手实践,使幼儿能按要求折出小白兔的形状;2、通过实践,培养幼儿动手操作能力及观察能...

    中班教案 日期:2017-03-07

  • 英语初中教案模板范文

    中学英语教案模板_英语教学设计(模板及范例)123初中英语教案范例Unit4Iwanttobeanactor 学校 1Unit4Iwanttobeanactor教学目标:1 学会不同工作的英文表达方式。2 了解同学父母的工作。3 学会简单的介绍自己将来的理想。教学内容:重点词汇:tea

    英语教案 日期:2017-04-05

  • 部队形势战备教育教案

    强军目标授课828(教案)聚焦强军目标投身强军实践党的十八大以来,习近平主席站在时代发展和战略全局的高度,对国防和军队建设做出了一系列重要指示,提出了在形势下建设一支听党指挥、能打胜仗、作风优良的人民军队的强军目标,为在新的历史起点上加快推进国防和军队...

    学案教案 日期:2017-03-03

  • 小班饮食安全教案十篇

    小班食品安全教案小班健康活动:饮食安全一、活动目标:1、了解吃各种食物(果冻、鱼、热汤、水果等)时要注意的安全事项,学会正确进食方法。、2、知道吃饭时不包饭和裹饭,细嚼慢咽才有利于健康,不要一边吃一边说话。二、活动准备:食物图片三、活动过程:(一)、教...

    小班教案 日期:2017-04-16

  • 小学语文无生上课教案

    小学高段语文无生试讲(通用模板)小学高段语文无生试讲(通用模板)【一】开场语——印象分1、进入讲课室,微笑着(表现出镇定自若)问好:各位尊敬的评委老师,大家上 下午好!我是XX号,请问我可以开始了吗?2、假设有学生的样子:上课!同学们好!请坐!【二】课...

    语文教案 日期:2017-05-11

  • 小班日常用品教案

    小班社会教案白河县幼儿园教师教学活动教案时间:2015年3月-7月单位:白河县幼儿园科目:社会年级:小(一)班教师:王能琴幼儿园小班第二学期社会活动计划小一班王能琴一、学情分析日常生活中我们的孩子都有一些简单的健康意识和养成的一些比较好的卫生习惯。但毕竟...

    小班教案 日期:2017-04-28

  • 大班体能教案及反思

    大班体育教学反思大班体育教学反思大班体育教学反思一:大班体育游戏《快乐做运动》活动设计教学反思一、设计意图:到了大班幼儿喜欢玩有竞争的游戏,且与同伴合作意识增强故本次《快乐做运动》活动的设计基于大班孩子这一特点,通过创设情景“蚂蚁搬运粮食准备过冬...

    大班教案 日期:2017-04-24

  • 简笔画hellokitty

      Hello Kitty诞生于1974年,当时三丽鸥公司预定推出一款小钱包,上面的图案希望能设计出一个崭新的人物。而Kitty的第一代设计师清水侑子在设计之初想到小孩子喜欢的动物,不外乎小熊、小狗和小猫而已,由于前

    卡通简笔画 日期:2017-08-18

  • 简笔画angelababy

      Angelababy(杨颖),1989年2月28日出生于上海市,华语影视女演员、时尚模特。2003年,Angelababy以模特身份出道,此后,她因担任时尚模特而在香港崭露头角。

    人物简笔画 日期:2017-08-18

  • 简笔画:康乃馨

      康乃馨,原名:香石竹,英文名:Dianthus caryophyllus 又名:狮头石竹、麝香石竹、大花石竹,拉丁文名:Dianthus caryophyllus L 石竹科、石竹属多年生草本,高40-70厘米,全株无毛,粉绿色。茎丛生,

    风景简笔画 日期:2017-08-18

  • 简笔画.白菜

       白菜,(Brassica rapa pekinensis,异名Brassica campestris pekinensis或Brassica pekinensis)为二年生草本植物,大叶,花淡黄色,原产于中国。[1] 又称结球白菜、包心白菜、黄芽白、胶菜等,在粤语里叫菜。

    果蔬简笔画 日期:2017-08-18

  • 简笔画,忧伤男生

      忧愁哀伤内心忧伤。每个人都有七情六欲。忧伤只是其中一种,是被动消极的情绪,忧伤是人的一种心理感受,是一种不快乐、不高兴的表现,忧伤会让人产生烦躁和不安的情愫,也是加速衰老的催化剂和强化剂。

    人物简笔画 日期:2017-08-18

  • 简笔狐狸画法

      哺乳纲,食肉目犬科动物。属于一般所说的狐狸,又叫红狐、赤狐和草狐。它们灵活的耳朵能对声音进行准确定位、嗅觉灵敏,修长的腿能够快速奔跑,最高时速可达50km h左右,所以主要以鱼、蚌、虾、蟹、鼠类、鸟

    动物简笔画 日期:2017-08-17

  • 简笔牛头图片大全

      魔兽系列中,牛头人在创造它的英语环境里称做托伦(Tauren)。在中文里,人们按照他们的种族外形习惯性的称他们为牛头人。

    优秀简笔画 日期:2017-08-17

  • 简笔海豚

      海豚(学名:Delphinidae)具有齿鲸类典型的形态学性状:纺锤形的身体;单个新月形的呼吸孔;头骨套叠,上颌骨向后扩展与额骨重叠;颅顶偏左的不对称;圆锥形或钉状的齿等。各种间最明显的变异与喙、上下颌、牙齿等

    动物简笔画 日期:2017-08-17

  • 简笔汽车图片

      我国国家最新标准《汽车和挂车类型的术语和定义》(GB T 3730 1—2001)中对汽车有如下定义:由动力驱动,具有4个或4个以上车轮的非轨道承载的车辆,主要用于:载运人员和(或)货物;牵引载运人员和(或)货物的车

    优秀简笔画 日期:2017-08-17

  • 简笔水晶鞋

      水晶鞋是《格林童话》中塑造的童话人物形象灰姑娘(Cinderella)的舞鞋。《灰姑娘》讲述的是一个孝顺且心地善良的女孩子,长期受到继母和姐姐们的虐待,在厨房里做女佣,每天都是灰头土脸脏兮兮的,后来由于善

    物品简笔画 日期:2017-08-17